基因工程实验技术教程

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绪论

本教程基因工程实验流程图

实验一 碱法抽提质粒DNA

一 实验目的

二 实验原理

（一）克隆载体pUC118质粒与宿主菌MV1184

1pUC118质粒结构

2MV1184宿主菌F＇因子基因型

3MV1184宿主菌染色体基因型

（二）质粒DNA的抽提

1裂解细胞

2分离

3纯化

（三）碱法抽提的主要试剂

（四）抽提产量与试剂用量的估算

1抽提产量估算

2试剂用量估算

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验二 电泳法测定DNA的浓度与纯度

一 实验目的

二 实验原理

（一）琼脂糖凝胶

（二）电泳时DNA迁移的影响因素

1DNA分子质量的影响

2DNA构型的影响

3胶浓度的影响

4电场强度的影响

5溴乙锭的影响

6电泳缓冲液的影响

7碱基组成与电泳温度的影响

（三）电泳缓冲液

1TAE

2TBE

3TPE

（四）上样液

（五）上样量的控制

（六）DNA电泳条带的检测

（七）电泳的分子质量梯度标志

1线状分子质量梯度标志

2超螺旋分子质量梯度标志

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验三 载体与供体DNA的酶切

一 实验目的

二 实验原理

（一）限制性内切酶的一般性质

1一般限制酶的识别位点

2识别超长碱基序列的酶

3各类粘性末端的特点

4同识别序列的酶

5酶切反应中的位点优先现象

6DNA构型对酶切的影响

7近末端切割

8酶的星号反应

9大肠杆菌中甲基化现象对酶切的影响

10能切割单链的限制酶

（二）限制性内切酶的使用

1制作基因图谱

2克隆基因

3制备探针

（三）酶切方式

1部分酶切

2完全酶切

（四）酶的质量鉴定

（五）酶的保存

（六）酶单位的定义

（七）限制酶的作用条件

1作用温度

2缓冲体系

3反应时间

4DNA的纯度与浓度

（八）终止酶反应的方法

（九）酶切失败的原因及处理的方法

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验四 目的基因片段的回收

一 实验目的

二 实验原理

（一）各类回收方法

1电泳回收法

2收集孔电泳回收法

3机械破碎凝胶回收法

4溶（熔）胶回收法

5琼脂糖酶降解凝胶回收法

（二）回收方法的选择与操作注意事项

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验五 载体与供体DNA的连接

一 实验目的

二 实验原理

（一）早期的连接理论

（二）近期的计算机模拟反应进程

（三）连接酶

（四）连接反应的影响因素

1连接缓冲液的影响

2pH值的影响

3ATP浓度的影响

4连接温度与时间的影响

5酶浓度的影响

6DNA浓度的影响

7DNA序列的影响

8其他抑制因素的影响

（五）三种连接酶单位定义

1Weiss单位

2d（A―T）环化单位

3粘性末端单位

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验六 CaCl2法转化大肠杆菌

一 实验目的

二 实验原理

（一）各种转化方法与转化率的衡量指标

（二）转化率的影响因素

1试剂（包括水）纯度与器皿清洁程度的影响

2接种前菌种保存方式的影响

3宿主菌生长时期的影响

4CaCl2法0℃放置时间的影响

5化合物与无机离子的影响

6质粒大小、构型与复制起点的影响

7竞争DNA的影响

8共转化质粒的影响

9质粒DNA与转化细胞比例的影响

10菌株基因型recA＋与recA 的影响

11连接缓冲液的影响

（三）大肠杆菌中的限制系统与限制修饰系统

1Mcr限制系统

2Mrr限制系统

3hsd限制修饰系统

（四）宿主菌的选择

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验七 酚/氯仿法快速鉴定转化子

一 实验目的

二 实验原理

（一）DNA水平检测

1快速抽提电泳分析

2快速抽提酶切分析

3原位杂交法

4斑点杂交法

5Southern杂交法

6DNA序列分析

（二）mRNA水平检测

1R环电子显微镜法检测

2杂交抑制翻译

3杂交选择翻译

（三）蛋白质水平检测

1沉淀免疫检测法

2其他免疫检测法

（四）功能水平检测

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验八 随机引物法标记DNA探针

一 实验目的

二 实验原理

（一）酶法标记于链上

1缺口转移法

2随机引物法

3PCR法

（二）酶法标记于末端

13′末端标记法

25＇末端标记法

（三）化学法标记于链上

1直接标记法

2介导标记法

（四）化学法标记于末端

1合成时引入氨基或巯基

2合成后引入氨基或巯基

（五）光化学法标记于链上

1芳香叠氮化合物

2呋喃香豆素衍生物

（六）人工合成于链上

1掺入碱基类似物

2掺入核糖类似物

（七）检测酶直接标记法

1检测酶直接标记于链上

2检测酶直接标记于末端

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验九 菌落原位吸印

一 实验目的

二 实验原理

（一）各类吸印膜

1硝酸纤维素膜（NC膜）

2叠氮氧苄甲基纤维素纸（DBM纸），重氮苯硫醚

纤维素纸（DPT纸）和氨基苯硫醚纤维素纸（APT

纸）

3二乙氨基乙基纤维素纸（DEAE纸）

4ECTELA纸

5尼龙膜

6聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）

7其他膜

（二）各种转移方法

1毛细管转移法

2真空转移法

3电转移法

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验十 DNA分子杂交

一 实验目的

二 实验原理

（一）DNA的复性与杂交反应动力学方程式

1双链DNA的复性过程

2单链探针的杂交过程

3双链探针的杂交过程

（二）杂交速率的影响因素

1探针分子复杂性的影响

2探针分子浓度的影响

3杂交温度的影响

4杂交液pH值的影响

5杂交液中离子强度的影响

6杂交液中甲酰胺浓度的影响

7杂交促进剂的影响

（三）杂交反应的两种模式

（四）杂交分子稳定性的影响

1杂交液中Na＋离子浓度的影响

2探针分子中GC％的影响

3杂交液中甲酰胺浓度的影响

4探针分子长度的影响

5与目标DNA错配的影响

6杂交液pH值的影响

（五）杂交的步骤

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验十一 显色法检测杂交结果

一 实验目的

二 实验原理

（一）酶法显色原理

1辣根过氧化物酶

2碱性磷酸酯酶

（二）免疫法检测原理

（三）生物素－亲和素法检测原理

（四）其他检测法

1胶体金标记――银加强检测法

2时间分辨荧光检测法

三 试剂与器材

四 实验步骤

实验十二 PCR法鉴定人的性别

一 实验目的

二 实验原理

（一）PCR的引物设计

1引物的长度

2引物的GC％含量

3引物的3′端起始碱基

4引物无回文对称结构

5引物自身不能配对

6两个引物的Tm值

7两个引物之间不能配对

（二）PCR的反应体系

1模板DNA

2引物

三 分光光度计的使用

四 电泳仪的使用

五 微量移液器的使用

六 凝胶摄影

七 酚的重蒸与饱和处理

八 RNA酶的使用与预处理

九 缓冲液作用原理与Tris・Cl的配制

十 菌种与DNA样品的保存

十一 器皿的清洗处理

十二 器皿和试剂的灭菌处理

十三 器皿的硅化处理

十四 大肠杆菌常用基因型

参考文献

作者简介

内容提要

本教程的实验是以pUC118质粒为载体克隆一卡那

霉素抗性基因，转化子鉴定用快速抽提酶切法与非放射

性标记探针的菌落原位杂交法。整个实验过程包括质粒

抽提、电泳、酶切、片段回收、连接、转化、快速鉴定、探针

标记、原位吸印、杂交与检测等基因工程的最基础的实验

步骤。除上述系列实验外还有一独立的PCR实验――用

头发进行人的性别鉴定。

本书可作为基因工程实验课程的教材，也可供生物

学科有关各专业教师和科研人员参考。

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