基因工程

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前言

20世纪70年代诞生的基因工程技术，开创了人类按照自己的意愿在体外操纵生命过程的新纪元。在随后的30～40年间，基因工程技术取得了巨大的令人鼓舞的成就。根据全国工程硕士专业学位教育指导委员会的建议，使攻读工程硕士学位的研究生能及时地了解和跟踪这一领域的最新进展，促进工程硕士研究生教育质量的提高，加强工程硕士研究生教育的核心教材建设，我们组织了富有基因工程技术教学经验和实际操作能力的教授编写了这本教材。根据工程硕士研究生现有的知识结构和实际情况,考虑到本课程的系统性，本教材的内容分为上、中、下3篇。将基因的信息流作为上篇，系统介绍基因的复制和表达及其调节控制的分子生物学基础理论；中篇重点讲解基因操作的基本技术和相关原理，其中包括目的基因的获得、基因的体外重组、基因的转化、重组体的筛选与检测、基因的扩增与表达等核心内容；下篇系统介绍基因工程技术在医药、食品、农业等领域取得的最新进展和实际应用，并就基因工程的安全性问题进行了简单的论述。基因工程已被指定为生物工程硕士专业的一门核心课程，本教材力求在介绍基因工程基本原理的基础上，结合基因工程实践中发展起来的最新技术和成果作一全面总结。期望通过本课程的学习，使研究生能掌握并熟悉基因工程的原理和基本操作技术，了解基因工程在植物、动物、微生物、医疗、制药等方面应用的策略、思路和最新进展。在本教材中，白林泉编写并校对了第5、6、7章,黄显清编写了第13章以及第11章的基因疫苗和基因诊断部分，杨立桃编写了第3章中的基因表达调控、第8章中基因定位以及第12章中的各种植物基因工程等有关内容，其余部分由许煜泉编写。许煜泉教授为本书做了全面的整合、修改和审定。感谢张红艳为本教材的编排做了大量工作。在本教材的编写过程中得到了清华大学出版社柳萍等有关同志的热情指导、帮助和支持，在此表示衷心的感谢。在本教材中选用了T. A. Brown编写的Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction(fourth edition)和P. C. Turner, A. G. Mclennean A. D. Bates, M. R. H. White编写的Instance Notes in Molecular Biology (second edition)教材中部分图谱，在此表示衷心谢意。我们对图谱的标注和内容做了翻译和修改。近年来，随着分子生物学的飞速发展，有关基因工程原理与技术的研究和进展迅猛异常，加之编写时间仓促和各位编写人员的学术水平、研究领域的局限性，书中出现错误和不足之处在所难免，衷心希望使用本书的研究生和同行专家提出宝贵的意见并给予批评、斧正，以便再版时加以进一步的改正和完善。

书籍目录

第1章 导论/11.1 基因的本质是DNA11.2 基因工程的诞生和发展11.2.1 基因工程的诞生11.2.2 基因工程的发展31.3 基因工程的应用4上篇 基因的信息流第2章 基因信息的复制/82.1 复制的基本概念82.1.1 半保留复制机制82.1.2 复制子和复制起始区92.1.3 半不连续复制92.2 细菌染色体DNA的复制122.2.1 复制起始122.2.2 延伸132.2.3 终止和分离142.3 细胞周期及其调控机制142.3.1 细胞周期142.3.2 关卡及其调节152.3.3 细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶152.3.4 细胞周期的活化和癌症162.4 真核生物DNA的复制172.4.1 起始区和复制的起始172.4.2 复制叉172.4.3 端粒的复制182.5 DNA的突变、修复与重组192.5.1 DNA的突变与损伤192.5.2 DNA修复222.5.3 DNA 重组25第3章 基因信息的转录/293.1 原核生物的基因转录303.1.1 大肠杆菌的RNA聚合酶303.1.2 大肠杆菌的σ70 启动子313.1.3 转录的起始、延伸和终止323.2 原核基因转录的调控353.2.1 乳糖操纵子363.2.2 色氨酸操纵子与衰减子383.2.3 更替σ因子调控转录413.2.4 菌群传感433.2.5 小RNA分子对基因表达的调控作用433.3 真核生物基因的转录453.3.1 3种RNA聚合酶的特点和功能453.3.2 RNA聚合酶I基因473.3.3 RNA聚合酶III基因483.3.4 RNA聚合酶II基因的启动子和增强子513.3.5 RNA聚合酶II的转录起始和基本转录因子523.4 真核生物基因转录的调控543.4.1 转录因子的特点583.4.2 转录因子与DNA结合的结构域593.4.3 转录因子中的转录活化结构域623.4.4 转录因子的抑制作用623.4.5 调节转录的靶位623.5 真核生物基因转录调控的实例633.5.1 构成性转录因子SP1633.5.2 甾醇类激素及其受体的调节作用633.5.3 信号转递和转录活化（STAT）蛋白的磷酸化调节643.5.4 人类免疫缺损病毒Tat蛋白活化转录延伸643.6 RNA转录本的加工和RNPs663.6.1 rRNA的加工和核糖体663.6.2 tRNA的加工、RNase P和酶活性RNA673.6.3 mRNA的加工、hnRNPs和snRNPs683.6.4 mRNA 加工方式的改变713.6.5 RNA的编辑713.6.6 miRNA及其加工72第4章 基因信息的翻译/744.1 遗传密码744.2 tRNA的结构和功能774.3 原核生物中蛋白质的合成794.3.1 密码子与反密码子的相互作用794.3.2 蛋白质合成的过程814.4 真核生物中的蛋白质合成844.5 翻译的调控机制和翻译后的加工87中篇 基因的克隆及其功能分析第5章 DNA的克隆/925.1 DNA克隆的载体935.1.1 质粒935.1.2 噬菌体955.2 DNA的制备985.2.1 制备细菌细胞总DNA985.2.2 制备质粒DNA1015.2.3 制备噬菌体DNA1055.2.4 DNA的定性和定量分析1065.3 DNA操作的工具酶1075.3.1 限制性核酸内切酶1075.3.2 DNA连接酶和连接反应1125.3.3 核酸酶1165.3.4 DNA聚合酶1175.3.5 磷酸酶1175.3.6 其他工具酶117第6章 DNA的导入技术及其载体/1186.1 DNA导入法1196.1.1 大肠杆菌中的常规转化1196.1.2 大肠杆菌的电转化1206.1.3 啤酒酵母细胞的转化1216.1.4 机械导入法1216.2 重组子的识别1226.2.1 抗性基因的插入失活1226.2.2 基于半乳糖苷酶基因lacZ的α-互补筛选1226.2.3 聚果糖蔗糖转移酶基因的筛选1236.3 噬菌体DAN导入细菌细胞1246.3.1 转染1246.3.2 噬菌体的转导1246.3.3 重组噬菌体的识别1256.4 大肠杆菌中的质粒载体1256.4.1 质粒pBR322的优良性质1266.4.2 其他典型的大肠杆菌质粒载体1266.5 基于M13噬菌体的克隆载体1286.5.1 M13mp2克隆载体的构建1296.5.2 具有多克隆位点的M13mp71296.5.3 复杂的M13克隆载体1306.5.4 质粒与M13杂合的克隆载体1316.6 以细菌噬菌体λ为基础的克隆载体1326.6.1 λ基因组中的非必需区1326.6.2 筛选限制性位点缺失的λ噬菌体1336.6.3 插入载体和取代载体1336.6.4 利用λ插入载体和取代载体的克隆试验1346.6.5 柯斯质粒1356.6.6 大容量载体： BACs和PACs1366.7 真核生物的克隆载体1376.7.1 利用酵母中的载体1376.7.2 高等植物的克隆载体1406.7.3 动物的克隆载体142第7章 目标基因的获得/1457.1 筛选克隆基因的两种基本手段1457.1.1 直接筛选1457.1.2 构建基因组文库1467.2 从文库中筛选目标基因1487.2.1 DNA分子探针和杂交1487.2.2 制备杂交探针1497.2.3 免疫学筛选1517.3 目标基因的化学合成1527.4 聚合酶链式反应（PCR) 1547.4.1 PCR的发展历史1547.4.2 PCR的过程1547.4.3 PCR的温度循环1557.4.4 PCR反应的优化1557.4.5 各种不同的PCR1587.4.6 PCR的后续工作1597.4.7 PCR的应用160第8章 基因的结构和功能分析/1648.1 基因的定位1648.1.1 Southern转移1648.1.2 正交交变电场凝胶电泳1668.1.3 原位杂交1678.2 基因所属连锁群或染色体的测定1688.2.1 系谱分析法1688.2.2 非整倍体测交法1698.2.3 四分体分析法1708.2.4 连锁群法1708.2.5 利用染色体易位的基因定位1728.3 基因在染色体上的位置测定1738.3.1 根据重组频率的基因定位1738.3.2 根据所测基因在某一已知染色体区段中是否存在的基因定位1758.3.3 根据并发事件的基因定位1768.3.4 根据基因行为的定位1768.3.5 测定绝对位置的基因定位1778.4 基因精细结构分析1798.4.1 根据重组频率的基因定位1798.4.2 缺失定位法1798.4.3 共转导定位法1798.4.4 体细胞重组定位法1808.4.5 基因转变的梯度定位法1808.5 DNA测序1818.5.1 链末端终止法1818.5.2 化学裂解法1838.5.3 PCR产物的直接测序1848.5.4 自动化测序1848.5.5 长序列拼接1858.6 基因表达的分析1868.6.1 电子显微镜下的核酸分子1878.6.2 利用核酸酶分析DNA-RNA杂合体1878.6.3 引物延伸法分析转录物1888.6.4 研究RNA转录物的其他技术1888.7 基因表达的调节研究1908.7.1 DNA蛋白质复合物的凝胶阻滞1918.7.2 足迹法与DNaseI1928.7.3 修饰干扰分析1928.7.4 缺失分析1938.7.5 报道基因1958.8 识别目标基因的产物和功能1968.8.1 杂交体释放翻译法和杂交体捕获翻译法1968.8.2 体外突变分析蛋白质功能1978.9 研究目标基因产物的相互关系2008.9.1 噬菌体展示2008.9.2 酵母双杂交系统200第9章 基因组学/2039.1 基因组序列的测定2049.1.1 鸟枪法2049.1.2 重叠群克隆法2069.1.3 遗传图谱法协助序列装配2079.2 后基因组时代——理解基因组序列2089.2.1 识别基因组序列中的基因2099.2.2 未知基因的功能测定2109.3 各种组学的研究2119.3.1 转录组学的研究2119.3.2 蛋白质组学的研究2129.3.3 代谢物组学的研究2139.4 系统生物学2139.4.1 系统生物学的目标2139.4.2 整合是系统生物学的灵魂2149.4.3 信息是系统生物学的基础2159.4.4 干涉是系统生物学的钥匙216下篇 基因工程的应用第10章 利用基因工程生产重组蛋白/22010.1 大肠杆菌中表达外源基因的专一性载体22010.1.1 表达载体中的启动子22010.1.2 基因盒和基因融合22310.1.3 大肠杆菌生产重组蛋白的困难22510.2 利用真核细胞生产重组蛋白22610.2.1 在酵母和丝状真菌中生产重组蛋白22610.2.2 在动物细胞和昆虫细胞中生产重组蛋白22810.2.3 利用动植物体生产重组蛋白229第11章 基因工程在医学上的应用/23111.1 生产重组药物23111.1.1 重组胰岛素23111.1.2 在大肠杆菌中合成人体的生长激素23311.1.3 重组凝血因子VIII的合成23411.1.4 合成其他重组人体蛋白23511.2 基因工程疫苗23611.2.1 疫苗与基因工程疫苗23611.2.2 基因工程亚单位疫苗23811.2.3 基因工程减毒疫苗23911.2.4 活重组疫苗24011.2.5 DNA疫苗24211.2.6 转基因植物口服疫苗24311.3 基因诊断24311.3.1 基因诊断的概念24311.3.2 基因诊断的原理24411.3.3 基因诊断的对象24511.3.4 基因诊断的特点24611.3.5 基因诊断的基本技术24711.3.6 识别人类遗传疾病相关的基因25311.4 基因治疗25511.4.1 基因治疗遗传疾病25511.4.2 基因治疗和癌症25611.4.3 基因治疗的伦理学257第12章 基因工程在农业上的应用/25812.1 增添基因与植物遗传工程26012.1.1 植物体自身生产杀虫剂26212.1.2 其他添加基因的课题26212.2 删除基因26412.2.1 反义技术的原理26412.2.2 反义RNA和番茄果实成熟的基因工程26512.2.3 反义RNA在植物基因工程中的其他应用26612.3 各种植物基因工程26612.3.1 转基因植物作为生物反应器生产药物26612.3.2 不断完善转基因植物稳定高效表达技术26712.3.3 转基因培育高产作物26912.3.4 转基因培育优质作物27012.3.5 转基因培育抗真菌病害的作物27112.3.6 转基因培育抗除草剂作物27312.3.7 转基因培育耐环境胁迫的作物27312.4 转基因植物的安全性27512.4.1 筛选标记的安全性27512.4.2 对环境产生不良后果的可能性276第13章 代谢工程/27713.1 代谢工程中的一些基本概念27813.1.1 代谢途径与网络27813.1.2 代谢通量及控制分析27913.1.3 初级代谢与次级代谢28013.2 代谢工程的基本过程与原理28213.2.1 代谢工程的基本过程28213.2.2 代谢工程的基本原理28313.3 代谢工程的基本技术28313.3.1 检测技术28413.3.2 分析技术28413.3.3 操作技术28413.4 代谢工程的应用28413.4.1 提高目标产物的产量或产率28513.4.2 表达外源蛋白28813.4.3 扩大底物利用范围28913.4.4 构建新产品生物合成途径29013.4.5 构建新的外源毒性化学物质降解途径29013.4.6 改良细胞其他生理特性29113.5 代谢工程与其他技术的关系29113.5.1 代谢工程与“组学”技术29213.5.2 代谢工程与计算系统生物学29313.5.3 代谢工程与蛋白质工程29413.5.4 代谢工程与组合生物学29413.5.5 全局转录机器工程技术29513.5.6 文库筛选技术29513.6 组合生物合成29613.6.1 聚酮合酶及聚酮类生物合成机理29613.6.2 聚酮类的组合生物合成298第14章 基因克隆和法医学/30114.1 DNA分析和罪犯嫌疑人的识别30114.1.1 利用分子杂交探针分析遗传指纹30114.1.2 PCR短串联重复序列和DNA图谱30214.2 利用DNA图谱研究亲属关系30314.2.1 具有亲缘关系的个人具有相似的DNA图谱30314.2.2 DNA图谱和罗曼诺夫的遗骸30414.3 性别的识别研究和DNA分析305参考文献/308

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《基因工程原理、方法与应用》作为工程硕士专业基因工程的核心教材，也可供各相关专业和学科的教师、学生和科研工作者参考。

作者简介

《基因工程原理、方法与应用》主要内容：基因工程是建立在基因分子生物学的理论基础上发展起来的一门年轻学科。《基因工程原理、方法与应用》首先以基因的信息流为线束，对基因的复制、转录、翻译以及基因表达调控的分子生物学理论作了系统介绍。在此基础上，详细讨论基因克隆的工具、基因操纵和重组技术、重组基因导入各种生物体的方法以及转基因生物中目的基因的监测及分析技术；同时，全面地介绍了基因工程对分子生物学的理论研究，在重组蛋白的合成以及医学、农业和法医学等各领域的应用中所取得的最新发展和成就。最后，讨论了转基因产品和生物技术对人体健康、环境安全以及伦理学上可能产生的危害及争论。

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